淡水漁業(yè)研究中心水產(chǎn)遺傳育種研究室董在杰研究員的團(tuán)隊從分子調(diào)控和外部因素等方面繼續(xù)對紅羅非魚的體色分化變異的遺傳機(jī)制進(jìn)行了研究。構(gòu)建了3種不同體色紅羅非魚(粉白、紅斑和黑斑)的microRNA文庫，進(jìn)一步驗(yàn)證了靶基因包括slc7a11, mc1r和asip在紅羅非魚體色分化變異中的重要性，并鑒定出了2個顯著差異表達(dá)的體色調(diào)控的microRNA miR-138-5p和miR-722；對slc7a11基因進(jìn)行了全長克隆、表達(dá)特性、細(xì)胞定位以及RNA干擾的研究；還從遺傳—環(huán)境互作方面研究了溫度和飼料中酪氨酸和胱氨酸對紅羅非魚體色的影響。部分研究成果已在2018年的《International Journal of Molecular Sciences》、《Aquaculture》、《水產(chǎn)學(xué)報》等期刊上發(fā)表。具體進(jìn)展如下：

1. 采用高通量測序構(gòu)建了3種不同體色紅羅非魚(粉白、紅斑和黑斑)的microRNA文庫，獲得了總共81,394,491個原始reads和158個顯著差異表達(dá)的miRNA (圖1)。通過靶基因預(yù)測和功能分析，驗(yàn)證了靶基因包括slc7a11, mc1r和asip在紅羅非魚體色分化變異中的潛在重要性。進(jìn)一步進(jìn)行了miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)分析（圖2），鑒定出了2個顯著差異表達(dá)的 miR-138-5p 和 miR-722在調(diào)控體色中重要作用。

2. 通過RACE PCR技術(shù)獲得了紅羅非slc7a11基因的全長cDNA序列，其包括3個亞型，全長分別為2159 bp, 2190 bp和2249 bp，克隆492，525和492個氨基酸（圖3）。實(shí)時熒光定量表明其在紅斑體色紅羅非魚的腹部皮膚中表達(dá)量最高（圖4）。免疫熒光定位顯示其蛋白集中在皮膚細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中（圖5）。為進(jìn)一步確定基因功能，進(jìn)行了slc7a11基因雙鏈RNA干擾研究，目前確定了最佳的注射部位，注射劑量和注射時間。通過尾靜脈注射5 μg/g 7天內(nèi)的干擾效果最好。

3. 飼料中添加不同水平的酪氨酸（0.5%, 1%, 2%）和胱氨酸（0.1%, 0.5%, 1%）飼喂紅羅非魚（15.04 ± 0.03 g).）68天，觀察其對體色調(diào)控重要作用的黑色素合成通路的影響。結(jié)果顯示，飼料中額外添加酪氨酸和胱氨酸顯著影響紅羅非魚皮膚黑色素含量和酪氨酸酶活力(表1和圖6)，以及酪氨酸酶基因和slc7a11基因的mRNA表達(dá)（圖7，圖8）。

（水產(chǎn)遺傳育種研究室 供稿）